导读: 顾建文,中国人民解放军306医院,vector,是指在基因工程重组DNA技术中,一种将DNA片段(目标基因)转移到受体细胞的自我复制DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。① 它可以在宿主细胞中保存和复制 氨苄青霉素抗性基因,氨苄青霉素抗性基因的作用顾建文,解放军306医院,整理 载体(vector) ,指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。 ①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制,且对受体细胞无害,不影响受体细胞正常的生命活动。 ②有多个限制酶切点,而且每种酶的切点最好只有一个,如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点,可适于多种限制酶切割的DNA插入。 ③含有复制起始位点,能够独立复制;通过复制进行基因扩增,否则可能会使重组DNA丢失。 ④有一定的标记基因,便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因,就可以作为筛选的标记基因。一般来说,天然运载体往往不能满足上述要求,因此需要根据不同的目的和需要,对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。 ⑤载体DNA分子大小应合适,以便操作。 基因克隆的载体类型:质粒载体,噬菌体载体,柯斯质粒载体,M13噬菌体载体,噬菌粒载体。 载体分类 质粒载体 质粒载体是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1~200 kb左右,kb为千碱基对),有的一个细菌中有一个,有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移,可以独立复制,也可整合到细菌染色体DNA中,随着染色体DNA的复制而复制。 噬菌体载体 利用噬菌体作载体,主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列,使其随左右臂一起包装成噬菌体,去感染大肠杆菌,并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。 病毒载体 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖,不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多,因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆,然后再引入真核细胞。 现在人们还在不断寻找新的运载体,如叶绿体或线粒体DNA也有可能成为运载体。 载体构建 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶,DNA连接酶和其他修饰酶的作用,分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后,将二者连接在一起,再导入宿主细胞,实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌(制作感受态细胞备用) 取装有液体培养基的3ml试管两支(依情况而定),每管加40-100μl菌种,过夜摇。 2、提质粒(也就是载体) 依照提质粒试剂盒中的说明书操作(根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次)。 3、酶切(双酶切产生粘性末端) 反应所需试剂 体积(单位:ul) 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液 2 所需限制性内切核酸酶 1 H2O 7 将加好的EP管置于37℃保温1-2h。(依照提酶切的具体步骤操作;为了达到最佳酶切的效果,最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度) 4、电泳检测 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,检测酶切是否成功。 回收胶:琼脂糖与缓冲液一比一制胶,经过切胶回收目的产物,也有目的产物纯化的功能; 检测胶:琼脂糖与缓冲液一比二制胶,为了检测目的条带与预期是否相符。 切胶回收与产物纯化是差不多的过程,所达到的目的是一样的:切胶回收也是一种纯化过程,它能去除非目的片段,然后用回收试剂盒进行纯化,能将很不纯的DNA溶液纯化;产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质,用纯化试剂盒,你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。 5、载体与目的基因连接 如果电泳检测酶切成功的话,则仔细将所需的片段切割下来,将胶体回收(依照胶回收试剂盒说明书操作);之后将回收的片段和载体连接。置于温箱,12-16℃,保温8-16h 6、转化(连接产物转化到感受态细胞中) 依照转化具体操作步骤做感受态,将上述连接产物进行转化实验,涂板培养,37℃, 12-16h。 7、单克隆检测 (1)挑单克隆 先将AMP从冰箱中取出,待融化后,在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的 AMP,用枪头混匀;取1.5 mlEP管5支(依情况可以多挑几管),给每支管中加500μL上述培养液,然后用接种环(或黄枪头)挑单克隆,挑完后用枪吹打;之后,将挑好的菌摇4-5小时,至混浊即可。 (2)单克隆检测 以每管摇好的菌液为模板,以原有的引物进行PCR,然后将PCR产物跑电泳,观察电泳图像中那几管的条带正确,将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL,加到3ml(有LB液体培养液,AMP+)试管中,过夜摇;第二天重摇,将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序,并保种。 注:①挑单克隆时,一定要挑单一圆润的菌落,有卫星斑的不挑。 ②别忘记往培养基中加AMP。 ③ 用接种环挑菌后,要在酒精灯上反复灼烧,然后再进行下一次挑菌。 三、注意事项 1. 连接产物可短时间在-20℃保存,使用时可以取出进行后续实验; 2. 在细胞转化时,冰浴和热激要严格控制好时间; 3. 连接反应是DNA重组过程中的关键步骤,其成败的重要参数之一就是温度,因此要控 制好连接温度。 4.进行黏末端连接时,会产生一定数量的载体自身环化分子,导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题,常采用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA片段的自身环化。 总结:以上内容就是对于氨苄青霉素抗性基因,氨苄青霉素抗性基因的作用的详细介绍,文章内容部分转载自互联网,希望对您了解氨苄青霉素抗性基因有帮助和参考的价值。
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